Recomendaciones preparación de muestras para Single Cell Multiome.
La calidad de la muestras es clave en el desarrollo de soluciones como Single Cell Multiome. Partiendo de una suspensión de núcleos, el flujo de trabajo Multiome genera bibliotecas RNA-Seq y ATAC-Seq que van a dar información tanto del perfil de expresión genética como de la accesibilidad a regiones abiertas de la cromatina. Esto les permitirá a los investigadores caracterizar mejor las poblaciones de células complejas y descubrir las interacciones reguladoras de genes para determinados procesos o patologías.
Dependiendo de la naturaleza de la muestras, 10x Genomics ha validado tres protocolos específicos para la obtención de núcleos y su posterior análisis con Single Cell Multiome. Por lo que, el primer punto a tener en cuenta en la preparación de estas suspensiones celulares es saber de qué tipo de muestra se parte, ¿se trata de tejido fresco o congelado? ¿Tejido o línea celular? En caso de que se trate de una suspensión celular de líneas celular o tipo PBMCs, la obtención de núcleos se debería basar en el protocolo demostrado Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. Por el contrario, si la muestra de partida es un tejido, habrá que valorar la facilidad de disociación que presente dicho tejido y la cantidad de debris que se presenten al disociarlo. Pues en base a esta premisa, 10x Genomics ha validado dos protocolos: Nuclei Isolation from Embryonic Mouse Brain Tissue for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing y Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing para tejidos fáciles y difíciles de disociar respectivamente.
Aun partiendo de estos protocolos demostrados y validados por 10x Genomics, es preciso optimizar ciertos aspectos para cada muestra en particular. Por ejemplo, la composición del buffer de lisis se puede encontrar en dichos protocolos; sin embargo existen dos opciones. Utilizar una concentración 1x para células en suspensión que no requieran disociación o, utilizar una concentración 0.1x para tejidos o células derivadas de tejidos que requieran un tiempo largo de lisado. El tiempo de lisis, es otro punto a optimizar. Lo recomendable es realizar un time course donde contabilizar y visualizar la integridad de los núcleos a distintos tiempos de permeabilización. Durante el proceso de obtención de núcleos, existen pasos de lavados y centrifugaciones. Si se trata de una muestra con un ratio de recuperación de núcleos bajo, la recomendación es utilizar velocidades altas así como un rotor de balanceo.
Como se ha comentado al comienzo de esta entrada, una suspensión nuclear de alta calidad es fundamental para los ensayos multiome. Por ello, hay dos aspectos para evaluar el estado de las mismas. En primer lugar, se recomienda llevar a cabo un estudio de viabilidad. Un simple contaje con Trypan blue podría ser suficiente para visualizar el número de células viables y no viables, con el objetivo de encontrar menos del 5% de células viables, lo que indicaría unas condiciones de lisado óptimas. Sin embargo, si la muestra procesada presenta una alta cantidad de debris, la mejor opción sería utilizar marcadores fluorescentes como el homodímero de etidio, pues permitiría distinguir los núcleos de los debris. Por otro lado, sería necesario hacer un estudio de la integridad de la membrana nuclear. Para ello, los núcleos han de visualizarse bajo un microscopio con una magnificación de al menos 40x. Un núcleo con una membrana intacta y, por lo tanto, apta para proceder con el ensayo, debe presentar un núcleo redondo y liso. Si por el contrario, el núcleo presenta ondulaciones o estructuras como “ampollas” alrededor del mismo, significa que el proceso de lisado es excesivo y está dañando los núcleos.
Finalmente, este control visual de las muestras nos permitirá chequear si esta suspensión está libre de debris y agregados. En situaciones con baja presencia de debris, utilizar filtros como Flowmi para limpiar la muestra sería suficiente. Si por el contrario, existe la presencia de grandes agregados, la recomendación es utilizar tampones de lisis más débiles.
Existen otras recomendaciones dependientes del tipo de muestras. Por ejemplo, en el siguiente enlace explican la importancia de eliminar los granulocitos de muestras como PBMCs o BMMCs, How do granulocytes affect my ATAC (standalone or Multiome) data? La mejor opción para eliminar estas células de las muestras es llevar a cabo un FACS; sin embargo, cuando esto no es posible también se podría tratar la muestra con DNasas que degradará cualquier fragmento de DNA ambiental.
Otro aspecto importante a tener en cuenta en la preparación de las suspensiones nucleares es la posibilidad de sortear o no las mismas: Can I sort nuclei for Single Cell ATAC sequencing or Single Cell Multiome ATAC + GEX? Lo más recomendable es llevar a cabo el sorting de las células y no de los núcleos, pues estos son más sensibles por lo que la membrana podría resultar dañada; además la elección del marcaje para el sorting también es importante.
En conclusión, antes de lanzarse con un experimento Single Cell Multiome, optimizar la obtención de una suspensión nuclear es crucial para obtener buenos resultados. Puede encontrar más información en el siguiente seminario online dedicado, exclusivamente a la preparación de muestras para Single Cell Multiome: Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing, o en soporte de la página web de 10x Genomics.