PCR digital, dejando paso a la nueva tecnología con aplicaciones médicas.

La PCR digital (dPCR), se trata de una tecnología puntera que permite una cuantificación absoluta con un grado de sensibilidad y precisión superior a las técnicas moleculares convencionales. Es por ello que esta técnica se utilice cada vez más en el ámbito médico.

El concepto de PCR (Polymerase chain reaction) fue descrito en los años 90 por Kally Muris (1), que consiste en la amplificación de secuencias genéticas específicas a través de la reacción en cadena de la polimerasa como su propio nombre indica. Conforme han pasado los años, la técnica molecular de PCR ha ido cambiando ajustándose a las necesidades de investigadores y médicos. La PCR digital trabaja bajo el mismo concepto de amplificación, pero con la peculiaridad de que, previo a la amplificación, la muestra se divide en microgotas en las cuales se espera tener una o ninguna de la región del ADN de interés. De esta manera, todas aquellas microgotas en las que haya amplificación presentarán fluorescencia y se contabilizarán como positivas frente al total de microgotas. La lectura de estos resultados está establecida por la Ley de Poisson, por la que se obtiene una cuantificación absoluta de copias por ul en base a una incertidumbre.

Dada la metodología de la técnica de la PCR digital, esta presenta varias ventajas frente a la convencional. Una de las principales ventajas es que en el caso de la PCR digital no es necesario generar una recta standard a partir de concentraciones conocidas pues su metodología permite obtener estos datos basándose en el ratio de microgotas positivas, es decir, con una copia del target de interés, frente al total.

La PCR digital es muy sensible y precisa y se puede utilizar de forma eficaz en la medición absoluta de ácidos nucleicos, la detección de genes raros y la cuantificación absoluta de la expresión génica. En la PCR digital, se puede lograr el nivel deseado de precisión aumentando el número de réplicas.

La PCR digital se puede utilizar para un análisis preciso de múltiples targets. Además, proporciona resultados fáciles de usar en formato digital.

Esta metodología tiene múltiples aplicaciones en distintas áreas como la oncología, enfermedades infecciosas, screening prenatal, control de calidad en alimentación entre otras. Por ejemplo, gracias a la PCR digital es posible la detección temprana de la recaída en pacientes de cáncer hematológico. Los resultados de un estudio llevado a cabo en IMEGEN e IBIMA indican que la dPCR constituye una metodología adecuada para la detección de quimerismo mixto permitiendo un pronóstico más rápido de la recaída temprana, lo cual favorece la supervivencia de los pacientes que han sido sometidos a trasplantes alogénicos de células hematopoyéticas (2).

Otro ejemplo de la potencialidad de la PCR digital en clínica es su aplicación para la detección y el seguimiento de las mutaciones de EGFR del plasma del paciente. En este trabajo, los autores muestran han diseñado un ensayo, dEGFR39, que no solo es útil para detectar mutaciones dirigidas a EGFR del plasma de pacientes con NSCLC (del inglés, non-small-cell lung cáncer) para desarrollar una terapia dirigida, sino también para evaluar el pronóstico después del tratamiento (3).

El estudio del estado de amplificación de HER2 es crucial en el tratamiento del cáncer de mama para determinar la indicación de la terapia dirigida anti-HER2. Sin embargo, evaluar la variación del número de copias de HER2 es un desafío, especialmente cuando el ADN del tumor se diluye en el ADN de células sanas. Stilla Technologies, a través de una nota técnica, muestra la capacidad que la metodología de la PCR digital es capaz de identificar de forma fiable amplificaciones de HER2 en muestras con baja fracción tumoral (4).

La PCR digital se ha convertido en una herramienta muy potente para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Stilla Technologies ofrece el sistema Naica con posibilidad de multiplexado gracias a su configuración de 6 canales. Además, cuenta con el soporte del software Crystal Miner el cual permite el análisis simple de las imágenes y exploración de resultados, además de un control de calidad fiable. Si quieres saber más, accede a la grabación del webinar «Introduction of High-plex Crystal Digital PCR for genetic diseases by Stilla Technologies» impartido por Clement Gay, Co-Founder- Director of business & corporate development en Stilla Technologies, y Alexandra Martin, Head Application Specialists en Stilla Technologies

Bibliografía

1. «Bartlett & Stirling (2003)—A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6».
2. Valero-Garcia J et al. Earlier relapse detection after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation by chimerism assays: Digital PCR versus quantitative real-time PCR of insertion/deletion polymorphisms. PLoS ONE. 2019; 14(2): e0212708
3. ARTICLEMolecular DiagnosticsPlasma-based early screening and monitoring ofEGFRmutations in NSCLC patients by a 3-color digital PCR assayXiang Song1, Jian Gong2, Xiaoling Zhang3, Xiaoyan Feng4, Hui Huang4, Min Gao4and Li Chu5,6
4. Detection of HER2 Copy Number Variation with Digital Crystal PCR Stilla Technologies.