En 2019 10X Genomics lanzó al mercado una solución que permite estudiar el transcriptoma total espacial de un corte de tejido congelado en OCT, es decir, es posible saber las coordinadas de cada RNA mensajero dentro de eso dicho corte de tejido previamente congelado.

Esta solución es compatible con la tinción del tejido con Hematosina y Eosina (H&E) y, además, en 2020 se lanzó al mercado Visium también compatible con la técnica de inmunofluorescencia. Un año después, 10X Genomics lanzó otra versión de Visium que es compatible con tejido parafinado (FFPE), y compatible también con la tinción del tejido con H&E o con inmunofluorescencia. Para estas dos versiones existen algunos aspectos iguales y considerables diferencias que vamos mencionar en este texto.

Una diferencia fundamental entre las dos soluciones Visium tiene que ver con el tipo de muestra que se quiere utilizar: tejido congelado en OCT o tejido parafinado (FFPE).

Por otro lado, existen también algunas consideraciones iniciales para tener en cuenta cuando se tiene que escoger qué solución Visium utilizar (Tabla 1). Hasta el día de hoy la solución Visium para tejido parafinado sólo es compatible con muestras de tejido Humano o de Ratón, y esto tiene que ver con la técnica de captura de los RNA mensajeros que utiliza sondas pré-diseñadas frente a los genes codificantes de ambas las especies (Tabla 2).

Consideraciones InicialesVisium para Tejido FrescoVisium para Tejido Parafinado
Especies compatiblesCualquieraHumano o Ratón
MuestraTejido fresco congelado en OCTTejido fijado en formalina y embebido en parafina (FFPE)
Preparación de la muestraProtocolo 10X GenomicsSin protocolo específico
Grosor de corte de tejido recomendado 10 µm5 µm
H&ECompatibleCompatible
InmunofluorescenciaCompatibleCompatible
Targeted Gene ExpressionCompatibleNo Compatible
Método de captura de RNA mensajerosDirectoIndirecto
Permite detectarPoly(A) RNAsRNA codificantes de proteínas
Calidad del RNARNA Integrity Number (RIN) > 7DV 200% > 50%

Tabla 1. Comparativa de puntos iniciales entre Visium para Tejido Fresco y Tejido Parafinado

Para ambas soluciones los slides utilizados son los mismos (Tabla 2), con un área de captura de tamaño fijo y con casi 5 mil spots, donde cada spot contiene millones de oligos constituidos por secuencias diseñadas específicamente para secuenciar en los equipos Illumina, para ubicar la proveniencia de cada transcripto capturado, para permitir el conteo exacto de la expresión de cada gene, y una cola poly(d)T para capturar los RNA mensajeros a través de su cola polyA.

El tipo de tratamiento de la muestra va a impactar la integridad de los RNA mensajeros presente en las células, por ejemplo, el método FFPE para preservar los tejidos es el más común y utilizado en el mundo histológico, pero puede dañar la cola polyA de los RNA mensajeros que es por donde los oligos os van a capturar.

Teniendo esto en cuenta, 10X Genomics ha desarrollado una nueva tecnología que se basa en una incubación del tejido con sondas pre-diseñadas frente a los genes codificantes y que incorporan una cola polyA artificial, permitiendo así capturar las sondas que se hibridan con los RNA mensajeros a través de la cola poly(d)T en los oligos.

Tecnología y BioquímicaVisium para Tejido FrescoVisium para Tejido Parafinado
Spatial Gene Expression Slide KitPN-1000188 y PN-1000185PN-1000188 y PN-1000185
Visium Acessory KitPN-1000194PN-1000194
Método de capturaCola poly(A) endógena (RNA)Cola poly(A) sintética (RHS)
Bioquímica en el slideTranscripción ReversaExtensión del DNA
Bioquímica fuera del slideFragmentation, Ligation, End Repair,
A-tailing, Ligation, and SI-PCR
SI-PCR
Slide ResetPosibleNo es possible
Tissue OptimizationNecesarioNo es necesario
Tissue Adhesion TestNo es necesarioNecesario
(solo compatible con H&E)

Tabla 2. Comparativa entre la tecnología y la bioquímica para Visium para Tejido Fresco y Tejido Parafinado

Para las dos soluciones Visium es importante averiguar la calidad del RNA antes de empezar (Tabla 1), aunque esa prueba sea diferente dependiendo de que tipo de solución se va a utilizar. Además, antes de empezar con el kit para expresión genética, existen optimizaciones que se tienen que hacer como es el caso del Tissue Optimization Kit para tejidos frescos y el Tissue Adhesion Test para tejidos parafinados (Tabla 2).

En pasos largos, el flujo de trabajo para las dos soluciones Visium es idéntico (Fig 1), todavía el flujo de trabajo para Visium FFPE incluye pasos adicionales de desparafinación, decrosslink y un paso extenso (durante la noche) para incubar las sondas con los RNAs mensajeros.

Fig 1. Comparativa del flujo de trabajo para Visium para Tejido Fresco y Tejido Parafinado.

Para preparar la secuenciación hay que tener en cuenta que se utilizan diferentes placas de indexado para cada solución, así como el número de ciclos necesario para el R2 (Tabla 3). Además, la profundidad de secuenciación es considerablemente inferior para la solución FFPE porque se está considerando solamente los genes eucariotas codificantes.

SecuenciaciónVisium para Tejido FrescoVisium para Tejido Parafinado
Placa de indexadoDual Index TT Set A (20 µl)Dual Index TS Set A (5 µl)
Ciclos para R29050
Profundidad de lectura50.000 pares de lectura por spot cubierto de tejido25.000 pares de lectura por spot cubierto de tejido

Tabla 3. Comparativa entre las especificaciones de secuenciación para Visium para Tejido Fresco y Tejido Parafinado.

Así siendo, cada solución Visium nos va a permitir obtener el transcriptoma total y saber su ubicación en el contexto espacial. Nos permite identificar estados y tipos celulares o biomarcadores, todavía, existen algunas diferencias especificas para cada tipo de muestra o proyecto que necesitamos estudiar.

Esta variedad que nos ofrece 10X Genomics nos posibilita implementar la mejor solución para cada caso. En caso de duda puede contactar con nosotros.

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