ADICIÓN DE MUESTRAS Y REACTIVOS

La cuantificación de proteínas a través de la técnica de Western blot, ha de llevarse a cabo dentro de un rango de detección lineal para que esta sea robusta y precisa. En Western blot cuantitativos el rango lineal de detección es el rango de muestra cargada que muestra una relación lineal entre la cantidad de proteína en la membrana y la intensidad de la banda.

Además, los análisis cuantitativos requieren un proceso de normalización frente a un control de carga, ya sea una proteína housekeeping o la carga total de proteínas. La cuantificación de proteínas mediante Western blot solo es fiable si la proteína de interés y el control de carga pueden detectarse dentro del mismo rango lineal (Figura 1).

Figura 1. Rango Lineal de detección para el control de carga y la proteína de interés

El amplio rango dinámico de detección ofrecido por el Odyssey® CLx y Odyssey Fc Imaging Systems captura los datos dentro de un amplio rango lineal (6 logs) en una sola imagen. Por lo tanto, podrá cuantificar con confianza las bandas correspondientes a las proteínas de interés y el control de carga.

QUÍMICA ESTABLE

La precisión, integridad y reproducibilidad de la membrana depende de la química de detección que elija. Para una cuantificación precisa, las señales deben ser proporcionales a la cantidad de proteína cargada.

La cuantificación mediante quimioluminiscencia puede ser difícil de controlar y optimizar, ya que se trata de una reacción enzimática. Adapte su flujo de trabajo a la detección mediante fluorescencia infrarroja cercano y obtenga datos consistentes cada vez.

La detección mediante fluorescencia es la forma más fácil de obtener señales proporcionales. La detección directa se realiza utilizando anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos de infrarrojo cercano. Estas señales fluorescentes NIR son esta-bles durante meses, no se usan enzimas ni sustratos.

La intensidad de las señales fluorescentes no se ve afectada por los tiempos de exposición, lo que hace que la fluorescencia sea más consistente y fiable para los  resultados cuantitativos (Figura 2).

Figura 2. Detección directa vs detección indirecta

ANÁLISIS FIABLES

No todos los programas de edición de imágenes están diseñados para analizar datos de Western Blot. Las características de los programas no compatibles pueden generar ajustes no lineales o que comprometen la integridad de sus resultados. Es por eso que LI-COR Biosciences ha desarrollado el software Empiria Studio™ con la ayuda de los editores de revistas de alto impacto.

Empiria Studio analiza las imágenes de Western blot procedentes del Odyssey® Imager, ofreciendo análisis y resultados que se ajustan a los estándares aceptados que garantizan la reproducibilidad en la técnica de Western Blot.
Empiria Studio™ es el único software que proporciona respuestas fiables para cada paso del análisis: validación del experimento y análisis del mismo.

Utilizando Empiria Studio™, podrá validar tanto los anticuerpos como el método de normalización, cuantificar la proteína de interés, comparar réplicas y llevar a cabo análisis estadísticos.
Además, Empiria Studio™ hace posible y fácil compartir los resultados con otros colegas, PI y revistas, exportando los datos en PDF, CSV o en paquetes zip que contienen todos los detalles del experimento para compartir con otros colega que también estén usando el software Empiria Studio™.

APRENDIZAJE EXHAUSTIVO Y ACCESIBLE

Los usuarios de Odyssey® Imaging Systems pue-den aprovechar los programas de capacitación personalizados sobre diseño experimental, mejores prácticas de diseño de imágenes, soporte de análisis de datos, técnicas de optimización de ensayos y métodos para cumplir con las pautas actuales de publicación de Western blot.

La capacitación consistente es clave para resulta-dos de investigación reproducibles. Capacite a los miembros de su laboratorio on line con protocolos de Western blots, tutoriales en video y recursos técnicos estandarizados en el Portal de Educación de Lambda U®.

Los cursos de la plataforma Lambda U® está orientados a nuevos estudiantes, a aquellos que necesitan un repaso, y a todos los demás que estén interesados. Su organización en cursos modulares le permite profundizar en aquello que necesite y ponerse a trabajar sin perder tiempo.

Domine los conceptos fundamentales y obtenga orientación de los expertos en la técnica de inmunodeteccion mediante Western blots.